크로마토그래피 공정

크로마토그래피 chromatography

: 고체상 지지체인 정지상과 액상인 이동상간의 물질 분포 차이에 의해 물질을 분리하는 방법 정지상과 이동상의 성질에 따라 여러 방법이 있다. 한가지만 수행하기보다는 목적에 따라 원리가 다른 두가지 이상을 조합해서 사용함 정제하고자 하는 단백질의 특성에 따라 사용하는 레진의 종류가, 레진의 크기에 따라 분해능이 달라짐

resin의 크기가 작을수록 해상도가 높다. 그렇다고 무작정 높은게 좋은가? 아니다. 작을수록 back pressure가 높아져 기기에 걸리는 압력이 높아지고 생산 단계에서 주로 쓰이는 peristaltic pump의 경우 고압을 견디지 못하기 때문에 적정 값을 찾는 것이 중요하다. 보다 정확한 분리를 요하는 경우 HPLC 사용한다.

Type of Chromatography	Advantages	Disadvantages	Resolution
Ion Exchange	Versatile resin choices	Protein solution must start at low [salt] = needs desalting	Medium ------- High
Hydrophobic Interaction	Can be used directly from ammonium sulfate precipitation	Relatively low resolution and binding capacity	Low ------- Medium
Affinity	Quick and specific	Resins and ligands can be expensive	Low ------- Medium
Size Exclusion	Distinct from other techniques, Can be used analytically or for buffer exchange	Long run time	Low -------------------------- High

 

1. IEX 이온교환 크로마토그래피

: 정지상이 전하를 띠고 있어 반대의 전하를 가진 물질이 결합

IEX	정지상
음이온 교환 AEX	(+) charged resin - DEAE(diethyl aminoethyl) - sepharose - Q-sepharose	이동상에 포함된 음이온을 잡음
양이온 교환 CEX	(-) charged resin - CM (carboxymethyl)- sepharose	이동상에 포함된 양이온을 잡음

결합한 물질은 이동상의 pH 조절하거나 염 농도 증가시켜 유리시킨다. 재조합 단백질들은 전하를 띠고 있기 때문에 이러한IEX로 쉽게 분리할 수 있어 강력한 방법. but D-25/DF 등을 이용해 탈염을 해서 salt가 없는 상태에서 진행해야 함

2. HIC 소수성 상호작용 크로마토그래피

대부분의 단백질은 외부에 친수성 아미노산을, 내부에 소수성 아미노산을 가지고 있지만, 염도를 높이면 수화(hydration) 정도가 떨어져 소수성 아미노산이 외부에 노출되어 소수성을 나타나게 된다.

: 소수성을 지닌 단백질을 소수성 정지상을 이용하여 소수성 결합에 의해 분리하는 방법.

부드러운 조건에서 실시되기 때문에 바르게 접힌 손상되지 않은 단백질을 구조상 유사한 오염단백질과 분리하는 데 유용하다.

sample prep 과정에서 탈염 대신 오히려 염을 넣어줘야 하므로 간편하지만 상대적으로 선택성이 좋지 않아 단백질이 섞여 나오기도 함

3. AC 친화 크로마토그래피

: 분리하려는 물질에 친화성을 가진 리간드를 결합시킨 지지체를 정지상으로 하여 이동상의 물질을 분리하는 기술

ex) protein A/G와 높은 친화력 가지는 단클론항체와 같은 면역글로불린의 Fc

=> protein A/G를 친화성 리간드로 결합시킨 지지체를 이용하여 분리 정제 가능

호르몬이나 성장인자들은 이들 수용체의 결합부위를 모방한 리간드를 결합한 지지체를 이용하여 친화 크로마토그래피를 실시할 수 있다.

정지상의 리간드에 결합한 물질은 pH를 변화시키거나 염도를 증가시켜 친화력을 약화시킴으로써 지지체로부터 유리한다. 

-> 목적으로 하는 바이오의약품만을 분리할 수 잇으므로 바이오의약품의 하부 공정에서 가장 많이 이용되고 있음

 

• 면역 친화 크로마토그래피

: 항원을 리간드로 결합시킨 지지체를 이용하여 항체를 분리하거나, 그 역으로 항체를 리간드로 결합시킨 지지체를 이용하여 항원을 분리하는 친화 크로마토그래피

항원-항체 간의 높은 특이성을 이용한 강력한 분리정제법이지만, 리간드에 결합한 항체나 항원을 가혹조건으로 분리할 때 리간드 단백질이 떨어져 나올 수 있는 흠이 있다.
따라서 친화 크로마토그래피를 실시한 후 면역 분석법 등으로 리간드 등의 유출 여부를 확인하여야 한다.

 

4. SEC (GC) 분자크기 배제 (젤 침투) 크로마토그래피

: 단백질의 모양과 크기에 따라 분리하는 방법. 다공성 젤을 사용하여, 분자량이 작은 물질은 내부로 침투할 수 있지만, 분자량이 큰 물질은 내부로 침투하지 못한다. 레진과 단백질간의 상호작용이 아닌 사이즈에 따른 분리이므로 wash와 elution 단계가 구분되어있다고 보기 어렵다. 

==> 분자량 큰 물질일수록 젤로부터 배제되어 컬럼으로부터 빨리 유출되고, 

분자량이 작은 물질은 천천히 유출된다.

--> 표적 바이오의약품을 단백질 분해물이나 응집체로부터 분리하는데 매우 유용

주로 가장 마지막 단계에서 사용. 시료의 양이 최소화될 때 사용하야 한다.

버퍼 조성이 용리에 직접적인 영향을 주지 않아 요구 조건에 따라 버퍼 조건 변화시킬 수 있으며 gel filtration 시에 가장 높은 용리 얻기 위해 시료의 양은 총 컬럼 부피의 5%를 넘지 않아야 한다.

 

5. Adsorption chromatography 흡착 크로마토그래피

: 정지상이 이동상보다 극성이 높아 단백질이 쉽게 흡착하며, 이동상의 극성을 높이면 흡착된 단백질이 유리