Liquid chromatography

 Principles

: 혼합물을 구성하고 있는 매우 유사한 성분들을 분리할 수 있는 중요한 분리법이다. 시료는 이동상에 의해 이동하는데, 이런 이동상은 관 속에 또는 고체 판 위에 고정되어 있는 용해되지 않는 정지상을 통해 지나간다. 두 상은 시료성분들이 이동상과 정지상 사이에서 분배 정도가 달라지도록 선택한다. 시료 성분 중 정지상에 세게 붙잡히는 성분은 이동상의 흐름에 따라 천천히 움직이는 한편 정지상에 약하게 붙잡히는 성분은 빠르게 운반된다. 이동 속도의 이러한 차이 때문

단백질이 녹아있는 시료(이동상)를 칼럼(고정상)에 흘려주며 물리화학적 차이에 따른 이동속도 차이로 분리한다. 얻고자 하는 단백질의 특성에 따라 다른 종류의 레진을 사용한다.

 

액체 이동상이 칼럼을 지나갈 때, 이동상의 components가 resin 또는 chromatography media로 알려진 고정상과 서로 다른 정도로 반응한다. 이동상의 molecules of interest는 고정상과의 physicochemical interactions 차이를 기반으로 분리된다.

이러한 상호작용은 분자의 크기(size exclusion chromatography), 전하(ion exchange chromatography), hydrophobicity(hydrophobic interaction chromatography), specific binding interactions(affinity chromatography) 등을 기반으로 일어날 수 있다.

고정상의 구성은 보통 분리 도중에 바뀐다.  ~ 각 compound는 고정상인 레진과의 상호작용 강도에 따라 용출되어 나온다.

tryptophan을 함유하는 아미노산은 280nm의 파장에서 검출될 수 있다. 이러한 원리로 크로마토그래피의 시스템에 부착된 UV detector나 spectrophotometer를 통한 단백질의 용출을 지속적으로 관찰할 수 있다. 결과로 얻은 크로마토그램은 용출되어 나온 단백질의 정량을 위해 분석된다. 각 피크는 칼럼에 의해 분리된 하나의 unique component를 나타낸다. 이 때 주의해야 할 점은 하나의 피크가 하나 이상의 단백질을 함유할 수 있어 elution fractions의 분석은 gel electrophoresis와 같은 방법을 필요로 한다는 점이다.

크로마토그램에서 첫번재 넓은 피크는 레진과 약하게 반응하거나 전혀 반응하지 않고 용출된 단백질을 나타낸다. 대부분의 경우에 칼럼은 이러한 첫번째 flowthrough 피크가 완전히 용출되고 A280 흡광도가 baseline으로 돌아올 때까지 binding buffer로 씻겨진다.

Figure 1. Example chromatogram showing a linear gradient elution

 

다음으로는 elution buffer의 비율을 바꿈으로써 레진과 강하게 상호작용하는 단백질이 용출된다. 분자의 물리화학적 특성에 율의 elution buffer의 구체적인 비율은 분리되어야하는 분자의 물리화학적 성질과 사용되는 크로마토그래피 media의 특성에 따라 정해진다. 분자의 순전하량에 따른 상호작용을 이용하는 IEX를 예로 들면 이온 강도가 점점 높아지는 elution buffer를 사용한다.

Figure 1의 빨간 선은 gradient elution을 나타내지만 단백질은 stepwise isocratic elution에 의해 용출될 수도 있다. 이 때 버퍼의 농도는 단계별로 바뀌는 양상을 띤다. Elution gradient와 flow rate, column length, resin particle size를 바꿈으로써 주어진 레진의 단백질 분리능(해상도)는 달라질 수 있다. 크로마토그래피 기법은 잘 분리되었다는 뜻인 뾰족하고 높은 피크로 최적화된다.

Figure 2. Oprimization of resolution by changing flow rate. 최적의 피크 분리는 229cm/hr에서 이루어진다.

 

Workflow

column equilibration → sample loading → washing → elution → cleaning in place(CIP)

1) Column Equilibration

: protein of interest, resin과 compatible한 버퍼를 칼럼에 흘려준다. 5-10 CVs 진행해줌

효과적인 정제를 위한 준비단계. filter wetting과 비슷한 느낌?

ex) HIC의 경우 hydrophobic interation resins과 단백질의 결합은 high ionic strength 환경에서 가장 효과적이다. 따라서 sample application 이전에 레진은 high ionic strength의 버퍼로 평형화되어야 한다.

 

2) Sample Loading

: 고정상과 단백질의 상호작용을 극대화 시키기 위해서 일반적으로 평형 버퍼와 같은 조성의 버퍼를 사용

sample loading하는 두가지 방법

• manual
• sample pump

샘플 로딩시 고려해야 할 중요한 부분은 대부분의 레진들이 단백질과 결합하는데 유한한 capa를 가진다는 점이다. 따라서 샘플을 overloading 하는 경우는 분리에 좋지 않다.

 

3) Column Washing

: 고정상에 붙지 않거나 약하게 결합한 단백질을 씻어내는 과정

평형 버퍼와 같은 조성의 워시 버퍼 사용

단백질이 더이상 용출되지 않아 검출되지 않을 때 까지 씻어준다. UV detector가 달린 크로마토그래피 시스템을 사용할 때, 칼럼은 280nm에서 흡광도가 baseline으로 떨어질 때 까지 씻어준다.

ex) Immobilized-Metal affinity chromatography (IMAC)의 경우 고농도의 이미다졸과 결합한 단백질을 용출함. 중간 정도 농도의 이미다졸을 포함하는 버퍼로 resin에 약하게 결합해있는 contaminating proteins 제거

 

4) Sample Elution

레진에 비특이적이나 약하게 붙어있던 단백질이 모두 떨어진 후, resin에 강하게 결합해있는 protein of interest를 떼어내는 단계

IEX에서 단백질은 high-ionic-strength buffer나 pH 농도 변화로 고정된 protein of interest의 electrostatic interactions 방해해 떨어뜨려줌

Elution Condition 설정에는 두가지 방법이 가능

• isocratic elution: stepwise fashion
• gradient elution: linear gradient fashion

염 농도를 계단식으로 (단계별로) 높여주며 단백질 용출시킴

염 농도 기울기를 주며 단백질을 용출시킴

5) Final Column Washing & Column Regeneration

NaOH로 CIP 진행. Conductivity = 0 시점까지 진행한 후 DW로 wash.

20% Ethanol로 채워서 보관

 

크로마토그래피를 통한 단백질 정제 후 SDS-PAGE 통한 확인 필요

 

Reference

Liquid Chromatography, BioRad

https://www.bio-rad.com/ko-kr/applications-technologies/liquid-chromatography-principles?ID=MWHAS7E8Z